《Razvoj novega posredovanega Cas13a/Cas12a"En-lon" dvojno test odkrivanja za gensko spremenjene pridelke
Gensko spremenjeni pridelki so bili široko zasajeni po vsem svetu in številne države so postopoma izboljšale svoje regulativne ukrepe, da bi zagotovile varnost gensko spremenjenih pridelkov. Razvoj hitrih in natančnih metod genetskega odkrivanja na kraju samem je zelo pomemben za kmetijstvo in biološko varnost in lahko ublaži pomisleke javnosti glede gensko spremenjenih izdelkov.
V tej študiji je raziskovalna skupina razvila novo reakcijo z enim loncem -- mira dvojnega odkrivanja v kombinaciji z dvojno CRISPR (MR-DCA metoda) za hkratno odkrivanje genetskih ciljev CAMV35S in NOS v gensko spremenjenih pridelkih, kar zagotavlja preprosto in učinkovito metodo odkrivanja za gensko spremenjene krogle.
Eksperimentalne metode
Dvojni izdelek Mira analizirata dvojni sistem Cas13a in Cas12A, da ustvarita dva neodvisna signala, ki se med seboj ne motita, nato pa fluorescentno barvo bere z osvetljevalnim instrumentom ali s testnim trakom z dvema T vrsticama, da dosežete odčitavanje dvojnih kanalov. Celoten postopek je zaključen v manj kot 35 minutah, pri čemer je meja zaznavanja do 20 izvodov.
(Načelo odkrivanja MR-DCA CAMV35S in NOS)
Celoten poskus je razdeljen na tri korake: MIRA ojačitev, reakcija CRISPR in dve metodi interpretacije rezultatov.
Gen CAMV35S se uporablja kot tarča Cas13A, gen NOS pa se uporablja kot tarča Cas12a. Zasnovana sta bila dva para Mira primerov. Sistem CAS13A prepozna samo RNA, zato je zasnovano območje prednjega temeljnega premaza, ki vsebuje promotor T7 za kasnejšo transkripcijo in aktiviranje CAS13A. V gen NOS se doda PAM. Zgornji dodatki zagotavljajo, da se lahko proteini CAS13A in CAS12A vežejo na svoje crRNA in med obema sistemi ni motenj ali navzkrižne reakcije.
Eksperimentalna situacija
Občutljivost in specifičnost
Vzorec smo razredčili v gradientu, da smo testirali intenzivnost fluorescence reakcije MIRA. Ugotovljeno je bilo, da je mogoče intenzivnost fluorescence še vedno zaznati pri koncentraciji vzorca 20 μl. Za poskus je bila končno izbrana koncentracija 20 μl.
(Za izračun razvoja barv in količinsko določitev intenzivnosti se uporabljajo različne koncentracije vzorcev in preskusni trakovi)
Za nadaljnjo oceno specifičnosti MR-DCA je raziskovalna skupina testirala mešane vzorce ne-transgenih živali in ne-transgenih rastlin. Rezultati so pokazali, da so imeli samo transgeni vzorci, ki vsebujejo CAMV35 in NOS, visoke fluorescenčne signale, medtem ko je bila intenzivnost fluorescence drugih vzorcev blizu intenzivnosti negativnega nadzora. MR-DCA se lahko uporablja kot specifična platforma za zaznavanje nukleinske kisline z dvojno tarčo.
24 vzorcev pridelkov je bil testiran z MR-DCA. Med njimi so 1, 2, 15, 16, 21 in 22 transgena koruza, ki vsebuje promotor CAMV35S. 7, 8, 23 in 24 so transgeni riž, odporen proti bolezni, ki vsebuje Terminator NOS. 3, 4, 11, 12, 13, 14, 17 in 18 so transgeni soji, ki vsebujejo promotor CAMV35S in Terminator NOS.
(Rezultati preskusov 24 vzorcev)
Hitra reakcija
Reakcijski čas je pomemben dejavnik pri odkrivanju na kraju samem. Raziskovalna skupina je opazila, da lahko fluorescenčne signale FAM in Hex zaznamo s fluorescenčnim instrumentom, ko je bil reakcijski čas 10 minut. Mira v kombinaciji z reakcijo CRISPR je po 15 minutah opazila tudi rumeno fluorescenco.
(Fluorescenčni signal v različnih reakcijskih časih MIRA)
(Razvoj barv preskusnih trakov v različnih reakcijskih časih MIRA in izračun kvantifikacije intenzivnosti)
Eksperimentalni zaključek
Eksperimentalni rezultati so pokazali, da ima dvojna Mira dobro specifičnost in lahko natančno pridobi produkte ojačanja CAMV35 in NOS. Sistemi CAS13A in CAS12A reagirajo neodvisno, ne da bi se medsebojno posegali. MR-DCA test lahko natančno zazna 20 kopij pri nizki temperaturi 35 minut, kar ima veliko vrednost pri odkrivanju gensko spremenjenih pridelkov na terenu.
Podatki o članku
Ime revije: 《Journal of Advanced Research Express
Naslov članka: 《Razvoj novega testa za dvojno odkrivanje z enim loncem CAS13A/CAS12A, posredovanim z enim loncem za gensko spremenjene pridelke
Faktor vpliva: 11.4
Raziskovalna skupina: Wang Xiaofu, Zhejiang Akademija za kmetijske znanosti