Travna kozica je pomembna gospodarska vrsta v kitajski industriji sladkovodnih ribogojstev. Vendar pa v zadnjih letihHepatopancreatic micsporidium(EHP), parazit, ki okuži hepatopancrease kozic, je močno vplival na industrijo. Ker trenutno ni učinkovitega zdravila ali cepiva za zdravljenje te bolezni, je hitro in natančno odkrivanje ključnega pomena za preprečevanje njenega širjenja.
A.Magnified 9. 0 × 1 0 3 -krat; B. Povečana 5,0 × 104 -krat.
Qiao Yi, Shen Hui, Wan Xihe, Fan Xianping, Jiang Ge, Li Hui, Wang Libao, Shi Wenjun, Cheng Jie. Izolacija in morfološko opazovanje hepatopankreanskega mikrosporja v Litopenaeus vannamei. Journal of Fishery Sciences of China, 2018, 25 (5): 1051-1058. Doi: 10.3724/sp.J.1118.2018.17430.
Zaznavanje EHP se opira predvsem na molekularne biološke metode, pri čemer je najpogostejša tehnologija PCR. Kljub temu, da PCR ponuja visoko občutljivost, potrebuje drago opremo za PCR in specializirano laboratorijsko okolje, zaradi česar je neprimerna za uporabo na terenu. Za reševanje tega vprašanja je raziskovalna skupina razvila dve metodi hitrega odkrivanja, ki temeljijo na tehnologiji Mira. Te metode ponujajo visoko občutljivost, hiter odziv in enostavno delovanje, kar omogoča učinkovito in hitro odkrivanje EHP v kozicah na kraju samem brez potrebe po zapleteni laboratorijski opremi, s čimer zapolni vrzel v trenutnih metodah zaznavanja.
Amplifikacijski reagenti, uporabljeni v študiji:
- DNK izotermalni komplet za hitro amplifikacijo (osnovni)
- DNK izotermalni komplet za hitro amplifikacijo (koloidna vrsta zlata)
MIRA Tehnologija je večnamenska izotermalna metoda hitre nukleinske kisline. Njegovo temeljno načelo vključuje usklajeno delovanje več funkcionalnih beljakovin pri temperaturah okolice, da se doseže hitro amplifikacijo nukleinske kisline, kar omogoča resnično prenosno odkrivanje nukleinske kisline na kraju samem.
Raziskovalne metode
Ekstrakcija vzorca
Raziskovalna skupina je zbrala vzorce okuženih in zdravih travnih kozic s treh kmetij kozic v provinci Liaoning in izvlekel DNK iz hepatopancreas kozic.
Oblikovanje temeljnih premazov
Trije sklopi Mira prajmov so bili zasnovani, ki so ciljali na gena serinskega proteina S8 v EHP (pristopna številka Genbank: 182063). Ta gen ima edinstvena aktivna mesta, kar zagotavlja specifičnost odkrivanja.
Zaznavanje Mira-Age in Mira-LFD
(A) Optimizirane reakcijske temperature RPA-starosti. M: DL 500 Marker; N: negativni nadzor; Sevi 1-5: 25 stopinj, 30 stopinj, 37 stopinj, 39 stopinj in 42 stopinj.
(B) Optimizirani reakcijski časi RPA-starosti. M: DL 500 Marker; N: negativni nadzor; 1: 10 min; 2: 20 min; 3: 30 min; 4: 40 min.
(C) Optimizirane reakcijske temperature RPA-LFD. N: negativni nadzor; 1: 25 stopinj; 2: 30 stopinj; 3: 37 stopinj; 4: 39 stopinj; 5: 42 stopinj.
(D) Optimizirani reakcijski časi RPA-LFD. N: negativni nadzor; 1: 5 min; 2: 10 min; 3: 20 min.
Za odkrivanje EHP sta bili uporabljeni dve metodi odkrivanja Mira, Mira-staroda (agaroza gel elektroforeza) in Mira-LFD (koloidno zlato lateralni imunološki test). Raziskovalna skupina je z eksperimentiranjem optimizirala reakcijske temperature in čase. Mira-Age je v 30 minutah pri 37 stopinjah okrepil ciljno DNK, Mira-LFD pa je v samo 10 minutah pri 37 stopinjah dokončal amplifikacijo, pri čemer so bili rezultati berljivi v 5 minutah.
Eksperimentalni rezultati
Specifičnost in občutljivost
(A) Specifičnost odkrivanja RPA-starosti. M: DL 1000 marker; P: Nosema Bombycis; 1: EHP; 2: encefalitozoon; 3: mikrosporidia; 4: Virus sindroma belih točk; 6: nenormalno; N: Negativni nadzor.
(B) Specifičnost odkrivanja RPA-LFD. P: Nosema Bombycis; N: negativni nadzor; 1: EHP; 2: encefalitozoon; 3: mikrosporidia; 4: Virus sindroma belih točk; 6: nenormalno.
(C) Občutljivost RPA-starosti z gradientnimi redčenjem rekombinantnih plazmidov. M: DL 500 Marker; N: negativni nadzor; 1: 4,7 × 10^5 kopij/µl; 2: 4,7 × 10^4 kopije/µl; 3: 4,7 × 10^3 kopije/µl; 4: 4,7 × 10^2 kopije/µl; 5: 4.7 izvodi/µL; 6: 4.7 izvodi/µl.
(D) Občutljivost RPA-LFD z gradientnimi redčenjem rekombinantnih plazmidov. N: negativni nadzor; 1: 4,7 × 10^5 kopij/µl; 2: 4,7 × 10^4 kopije/µl; 3: 4,7 × 10^3 kopije/µl; 4: 4,7 × 10^2 kopije/µl; 5: 4.7 izvodi/µL; in 6: 4.7 izvodi/µl.
Poskusi so pokazali, da ima tehnologija MIRA visoko specifičnost, saj natančno zazna EHP, ne da bi reagirala na druge patogene. Glede na občutljivost sta imeli obe metodi mejo zaznavanja 4,7 kopij/µL, kar je bistveno višjo od občutljivosti tradicionalnega PCR.
Klinično testiranje vzorca
Rezultati testiranja 30 kliničnih vzorcev so pokazali, da sta imela Mira-Age in Mira-LFD stopnjo pozitivnosti 70%, nekoliko nižja od 80%QPCR, vendar bistveno višja od tradicionalnih 56,7%.
Možnosti za prijavo
Metode odkrivanja, ki temeljijo na MIRA, omogočajo hitro ojačanje ciljnih genov pri konstantnih temperaturah. Zlasti metoda Mira-LFD lahko doseže rezultate v samo 10 minutah brez potrebe po zapleteni laboratorijski opremi, zaradi česar je idealna za uporabo na kraju samem na kmetijah kozic. Visoka občutljivost in specifičnost te tehnologije je učinkovito orodje za zgodnje odkrivanje in nadzor EHP, s čimer se zaščiti zdravje in razvoj industrije gojenja travnih kozic.
Med temi metodami je imunološki test iz koloidnega zlatega bočnega pretoka (MIRA-LFD) še posebej primeren za uporabo na kraju samem zaradi svoje preprostosti in intuitivnih rezultatov. Kmetje s travnimi kozicami lahko hitro odkrijejo in se odzovejo na okužbe z EHP, izboljšajo zmogljivosti za nadzor bolezni, znatno povečajo učinkovitost kmetovanja in zmanjšajo gospodarske izgube.