Staphylococcus haemolyticus je gram-pozitivna koagulazna negativna bakterija, ki je v bolnišnicah zelo pogosta. V zadnjih letih se je vse večja zaskrbljenost zaradi velikega tveganja za bolnišnične okužbe. Staphylococcus haemolyticus lahko še dodatno povzroči kožne okužbe, meningitis, peritonitis in celo sepso. Zamude pri klinični diagnozi lahko privedejo do poslabšanja zdravstvenih stanj, zato je hitra diagnoza stafilokoka hemoliticusa ključna za natančno zdravljenje.
Raziskovalna skupina profesorja Ji Tuo z oddelka za Centralni laboratorij Lianyungang Second People's Hospital je objavila članek "Hitro in vizualno odkrivanje Staphylococcus haemolyticus v kliničnih vzorcih z Mira-LF" v reviji "Analytica chimica acta", s faktorjem 6,2.
Pregled študije
V tej študiji je skupina prof. Ji Tuo vzpostavila metodo za odkrivanje stafilolitika hemolitika s strani mira-LF, ki temeljijo na genu MVAA, in uporabila več-encimsko temperaturno hitro temperaturno amplifikacijsko tehnologijo MIRA v kombinaciji z lateralnim pretokom pretoka, da bi dosegli hitri odvzemu patogena. Poskus je bil izveden pri 37 stopinjah, rezultate pa smo odkrili v 9 minutah z občutljivostjo za zaznavanje 0. 147 CFU/reakcije. Metoda odkrivanja MIRA-LFS je primerna za odkrivanje fiksne točke Staphylococcus haemolyticus v kliničnih vzorcih in realizira metodo identifikacije Staphylococcus haemolyticus s pomočjo PoCT, ki je zelo koristna za hitro diagnozo in zdravljenje bolezni. Raziskovalna skupina je za analizo 95 naključnih kliničnih vzorcev uporabila MIRA-LFS, QPCR in tradicionalne metode bakterijske kulture in potrdila klinično uporabnost.
Raziskovalne metode
Zgoraj je prikazan shematični diagram testa Mira-LFS. V tej študiji smo uporabili komplet za hitro amplifikacijo AMPFuture Biotech DNA konstantne temperature (koloidni testni trak za zlato) in preskusni trak za odkrivanje nukleinske kisline.
Dolžina temeljnega premaza gena MVAA je bila 30-35 nukleotidi, dolžina ojačevalnega izdelka pa je bila 100-350 bp in oblikovali je skupno 6 parov kandidatnih prajmov. Za analizo MiR je bila uporabljena gDNA standardnih sevov Staphylolitic Staphylococcus, pregledani so bili kandidatni prajmerji in amplificirane izdelke vizualizirali z 2% agaroznim gel elektroforezo.
(Ojačevalni izdelki so prikazani z uporabo elektroforeze agaroze))
Sonda je nato zasnovana v skladu z zaporedjem prednjega temeljnega premaza (16 bp nazaj). 5 'konec sonde je označen s FITC, 3' pa je označen C3. Nukleotid položaja 31- v sondi se nadomesti s THF na razdalji 30 bp od konca 5 'in 15 bp od konca 3'. 5 'konec izbranega povratnega temeljnega premaza je označen z biotinom.
(Shematski diagram navzkrižnih dimerov in spreminjanja zaporedja kombinacij temeljnih barv)
Poleg tega so bili optimizirani reakcijski pogoji za odkrivanje Mira-LFS s stafilokokom hemolyticus. Testi se izvajajo na 37 stopinjah od 4-12 min v 2 min intervalih. Rezultati so prikazani v 8 -minutnem reakcijskem času, testna črta pa je jasno vidna. Poleg tega se test izvaja iz 22-52 stopnje v intervalih 5 stopinj. 37-42 stopnja je najprimernejša temperatura za odkrivanje Mira-LFS. Zato sta bila optimalni reakcijski čas in temperatura metode Mira-LFS za Staphylococcus haemolyticus 8 min oziroma 37 stopinj. Skupaj z dejstvom, da končni rezultat vizualizira LFS v 1 min, je skupni čas zaznavanja 9 minut.
(Optimizacija reakcijskega časa in temperature)
Eksperimentalni rezultati
1. Preverjanje občutljivosti
Za mira-LF so bile testirane različne koncentracije genomske DNA (gDNA), dobljene s serijskimi redčenjem kultur Staphylococcus Haemolytica (1 0^6-10^0 cfu/ml).
(Pozitiven signal pri različnih koncentracijah)
Verjetnostna regresijska analiza enote je pokazala, da je bila 95% LOD, določena s testom Mira-LFS, 0. 147cfu/reakcija.
(Omejitev izračuna zaznavanja)
2. Validacija specifičnosti
Selektivnost odkrivanja MIRA-LFS je bila določena z analizo 18 sevov skupnih patogenih mikroorganizmov in 15 sevov kliničnega stafilokoka hemolyticus. Rezultati so pokazali, da je bil test Mira-LFS negativen za vseh 18 drugih patogenih bakterij in pozitiven za 15 preverjenih kliničnih vzorcev Staphylococcus haemolyticus.
(Testirali smo 8 sevov standardnih patogenih bakterij in 15 sevov kliničnega hemolitičnega streptokoka)
Test Mira-LFS ima visoko selektivnost in je primeren za presejanje Staphylococcus haemolyticus.
3. Dejansko testiranje vzorcev
Skupno 95 vzorcev je bilo naključno zbranih iz drugega ljudskega bolnišnice Lianyungang, vključno s 35 vzorci kože in mehkega tkiva, 16 vzorcev urina, 14 vzorcev sputuma in 30 vzorcev krvi.
(95 kliničnih vzorcev smo testirali z različnimi metodami)
Rezultati so pokazali, da je bila metoda odkrivanja 100% skladna z metodo QPCR. Poleg tega sta bila v primerjavi z zlatim standardom (GB/T4789. 11-2003) občutljivost in specifičnost testa Mira-LFS za identifikacijo okužbe s stafilokok hemolytica 100% oziroma 98,73%. Ti rezultati nadalje potrjujejo tehnično izvedljivost metode pri odkrivanju Staphylococcus haemolyticus v kliničnih vzorcih.
Metoda Mira-LFS se uporablja za hitro odkrivanje stafilokoka hemolyticus s POCT, ki je učinkovit, natančen, preprost in stroškovno učinkovit, kar je koristno za hitro diagnozo in odločitve o zdravljenju.